在ELISA中一般有兩次抗原抗體反應，即加酶結合物和顯色劑后。抗原抗體反應的完成需要有一定的溫度和時間，這一保溫過程稱為溫育(incubation)，有人稱之為孵育。

溫育的時間選擇

溫育這一步是ELISA測定中容易出現(xiàn)問題的步驟。目前國內(nèi)ELISA試劑盒的反應溫育時間為37℃ 30分鐘-1小時，進口ELISA試劑盒則通常為37℃ 1-2小時才能有較*的結合，低于1小時，可能會影響測定下限。

ELISA屬固相免疫測定，抗原、抗體的結合只在固相表面上發(fā)生。以抗體包被的夾心法為例，加入板孔中的標本，其中的抗原并不是都有均等的和固相抗結合的機會，只有貼近孔壁的一層溶液中的抗原直接與抗體接觸。這是一個逐步平衡的過程，因此需經(jīng)擴散才能達到反應的終點。在其后加入的酶標記抗體與固相抗原的結合也同樣如此。這就是為什么ELISA反應總是需要一定時間的溫育。

溫育所需時間與溫度成反比，即溫度越高，則所需時間相對較短。

溫育的溫度選擇

溫育常采用的溫度有43℃、37℃、室溫和4℃（冰箱溫度）等。37℃是實驗室中常用的保溫溫度，也是大多數(shù)抗原抗體結合的合適溫度。

在建立ELISA方法作反應動力學研究時，兩次抗原抗體反應一般在37℃經(jīng)1-2小時，產(chǎn)物的生成可達。為加速反應，可提高反應的溫度，有些試驗在43℃進行，但不宜采用更高的溫度。抗原抗體反應4℃更為*，在放射免疫測定中多使反應在冰箱中過夜，以形成多的沉淀。但因所需時間太長，在ELISA中一般不予采用。

溫育的方式選擇

溫育方式常采用溫箱法、微波輻射法和水浴法。其中水浴法能較好解決因受熱不均衡所致的周圍孔與中央孔結果的吸光度差異（“邊緣效應”即外周孔顯色較中心孔深）?？蓪LISA板置于水浴箱中，板底應貼著水面，使溫度迅速平衡，為避免蒸發(fā)，板上應加蓋，也可用塑料貼封紙或保鮮膜覆蓋板孔，此時可讓反應板漂浮在水面上。

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若用溫箱，ELISA板應放在濕盒內(nèi)，濕盒要選用傳熱性良好的材料（如金屬等），在盒底墊濕的紗布，后將ELISA板放在濕紗布上。濕盒應先放在保溫箱中預溫至規(guī)定的溫度，特別是在氣溫較低的時候更應如此。為避免酶標板底部受水汽或磨損導致的讀數(shù)誤差，一般采用鼓風恒溫箱保溫，這個過程必須在酶標板上方貼封紙，以免蒸發(fā)。

無論是水浴還是濕盒溫育，反應板均不宜疊放，以保證各板的溫度都能迅速平衡。室溫溫育的反應，操作時的室溫應嚴格限制在規(guī)定的范圍內(nèi)，標準室溫溫度是指20-25℃，但具體操作時可根據(jù)說明書的要求控制溫育。

室溫溫育時，ELISA板只要平置于操作臺上即可。應注意溫育的溫度和時間應按規(guī)定力求準確。為保證時間精確，一個人一次不宜多于兩塊板同時操作、測定。

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關于溫育，在實際測定操作中應注意

不同的溫育環(huán)境對檢測結果有影響，操作中應嚴格按照說明書控制溫育時間及溫度，并注意封閉避免邊緣效應。

為確保各板溫度都能迅速達到平衡，不可將反應板疊加放置，設定的溫度及時間嚴格按照說明書進行，一般加入待測標本后使其與固相抗原(抗體)置于37℃環(huán)境下溫育。因為很多恒溫箱的構造，溫度及檢測的溫度并非酶標板溫育溫度，所以使用恒溫箱溫育時建議將溫度計置于酶標板旁，保證酶標板旁溫度為37℃。

干育和水溫的影響差異較為明顯，建議使用水溫，注意將固相板放入水中，防止受熱不均勻。

試劑盒一般設定的反響溫度為 37℃，在這個溫度下放置 30 分鐘，蒸騰的水分會許多，對于全部反響體系來講，各種反響物的濃度會不斷添加，這么必會致使反響畢竟的值添加，溫育時貼封片或加蓋，避免標本或稀釋液蒸發(fā)，吸附于孔壁。

試劑盒斷定的一定溫度下的反響時間并不是反響的完畢，添加反響的溫度，會加速反響，一樣添加時間會延伸反響，這么得到的反響程度會比試劑盒斷定的反響程度多，也會引起陰性高值或假陽性。

實驗操作的嚴謹性與實驗操作規(guī)范密不可分，未使用的試劑應儲存于2-8℃，使用時應回溫到室溫（20-25℃）。切忌不同批次的試劑混合使用，要經(jīng)常檢查酶標儀和微量移液器的精度和準備度……  ELISA看起來很簡單，但是在實際操作過程中，絕不能掉以輕心，除了嚴謹規(guī)范的實驗操作，高品質(zhì)的試劑盒與專業(yè)的技術團隊也是獲得準確結果的保證！